打破疫苗研制的“天花板”

每次我们达到一个新的“天花板”，便会在几年内打破它。

疫苗是科学对抗感染的胜利。它们击败了世界卫生组织在1980年宣布已被彻底根除的天花，并且大幅减少了很多其他传染疾病的死亡人数。

但这并非全部。美国国立卫生研究院疫苗研究中心免疫学家Mario Roederer表示，寻找对抗诸如艾滋病和疟疾等疾病的疫苗，一直因研究人员对人类免疫系统的了解不够充分而受到阻碍。

Roederer说，研究人员大体上知道一种成功的疫苗会帮助启动抗体生产和其他防线。不过，他们并不清楚免疫系统上千种或更多发挥作用的细胞类型中有哪些指挥着对抗单个病原体的反应。Roederer表示，如果研究人员能确认这些细胞类型，那么他们就可以设计出使这些细胞的生产最大化的疫苗。

确认这些细胞的最好方法之一是流式细胞术。它能根据细胞的显著特征（通常是外表面的蛋白）分析并分类细胞，同时显示很多关于一个细胞在免疫系统中的功能和位置的信息。不过，当前一代流式细胞术还不够详细，只能将细胞进行宽泛的分类，类似于把某种东西简单地确认为鱼而不是大白鲨。

辨别特定细胞的能力或许还有助于增进研究人员对诸如多发性硬化症、转移性癌症等疾病的理解。在多发性硬化症中，免疫系统会攻击受体的自身组织，而在转移性癌症中，来自原始肿瘤的危险细胞会迁移到其他组织中。

这样的可能性激发研究人员开发出两种新的方法，而每种都有望到2016年使传统技术的限度增加两倍甚至三倍。一种方法是对标准流式细胞术的变通，利用一种新型的荧光染料并且能确认27种蛋白。斯坦福大学免疫学家Garry Nolan介绍说，另一种叫作大量细胞计数法，能记录诸如细胞表面蛋白或蛋白组成部分等50种参数。

研发出新型染料

像免疫系统一样，流式细胞术利用抗体寻找蛋白。首先，研究人员为其想要研究的每种蛋白创建抗体，然后用能吸收光并发出特定颜色荧光的染料分子为抗体作标记。

随后，要研究的样品被“浸入”得到标记的抗体中，而这些抗体能黏附在承载相应蛋白的细胞上。被抗体装饰的细胞被指挥着一个一个地穿越狭窄的通道。当它们通过时，光脉冲触发染料发光，并显示哪种蛋白存在于细胞表面。来自每种染料的光以不同的波长呈扇形散开，从而产生看上去像山峰的读出器。

目前，流式细胞术一次能处理不超过18种荧光染料，因为当超过这个数量的染料同时发出荧光时，一些光谱的肩状突起部分将和其他的波峰重叠，使波峰无法被识别。

一个并发因素是每种蛋白的丰度在不同细胞之间变化很大。在其表面拥有上千个某种特定蛋白的细胞，会吸引很多标记相同的抗体，而它们会结合起来产生很亮的荧光。数量较少的蛋白则产生相对微弱的信号，使其可能被来自更加丰富的蛋白的信号淹没。

Roederer介绍说，研究人员可以通过使用较亮的染料标记那些靶向不太常见蛋白的抗体进行补偿，但通常无法提前知道蛋白的相对丰度。因此，他们可能不得不花费数周，依靠反复试验确定哪种抗体用哪种染料。

不过，这很快将被彻底改变，因为研究人员已开发出一种新型染料。它们由导电的塑料聚合物制成，能像微型天线一样在共同发出荧光的多个点吸收来自光脉冲的能量，从而产生更加强烈的信号。Roederer表示，当被用于流式细胞术，强烈的信号会淹没来自其他染料的任何重叠，即使是对于低丰度的蛋白而言。这意味着更多的染料可被同时使用。Roederer小组已利用染料调查了30种通常在免疫细胞表面存在的蛋白，尽管研究结果尚未发表。

其他研究团队正在利用两家位于加利福尼亚州的公司提供的染料。这两家公司一个是位于圣何塞的BD Biosciences，一个是位于圣地亚哥的BioLegend。不过，Roederer还未听说有其他人成功地同时测量出超过18种参数。

目前，Roederer计划利用这些染料研究对抗包括埃博拉、疟疾、肺结核和艾滋病等在内的多种疾病的候选疫苗。一种正在人类志愿者身上进行测试的埃博拉疫苗成为首要任务。Roederer加入了一个由同样来自疫苗研究中心的免疫学家Nancy Sullivan领导的团队。他们缩小了保护猴子免受埃博拉感染的细胞范围。通过使用更多染料，Roederer希望查明赋予猴子免疫力的细胞群。之后，Sullivan和Roederer希望调整疫苗剂量和注射时间表，从而使人类免疫系统产生并支持这些细胞。

利用稀土金属替代非荧光染料

当Roederer在新型染料方面取得进展时，位于加利福尼亚州森尼韦尔市的DVS Sciences公司正在从另一个方向使用流式细胞术。这家如今已改名为Fluidigm的公司在2009年首次引进商业化的质谱流式细胞技术，并在2013年第一次推出其下一代机器CyTOF 2。

像流式细胞术一样，质谱流式细胞技术也是将细胞浸入得到标记的抗体中，然后将其塞进一个狭窄的流道中并逐个筛选。不过，这就是两种技术的相似性结束的地方。质谱流式细胞技术利用在生命系统中“缺席”的稀土金属替代荧光染料标记蛋白。同时，它不是通过细胞发出荧光来显示蛋白的存在，而是利用等离子体将细胞分解成构成它们的原子。随后，这些包含了稀土标记物的原子被送到质谱仪中，以测量每种金属的质量和丰度。每种相应蛋白的身份和丰度也因此被测量出来，荧光染料存在的信号重叠问题也不复存在。

由Nolan领导的小组利用该技术在从髋关节置换手术中恢复的病人中寻找特定的免疫细胞群。该团队采集了每位病人在术前和术后不同阶段的血液，并且利用质谱流式细胞技术追踪了31种蛋白。在那些很快就恢复了的病人体内，研究人员发现了被称为单核细胞的独特免疫细胞类型。斯坦福大学病理学家、该研究参与者Sean Bendall介绍说，目前他们正在研究能否利用这些细胞预测哪位病人有可能出现延迟恢复，从而提供可改进其恢复时间的干预措施。

质谱流式细胞技术和荧光流式细胞术在一些相同的研究应用上出现了竞争，而研究人员往往拥有一种首选技术。Roederer认为，质谱流式细胞技术会破坏细胞，而荧光流式细胞术能保护细胞，甚至能将其同时分离和分类。

不过，Bendall并未有同样的担忧。他满腔热情地支持质谱流式细胞技术，但表示自己经常听到关于细胞被破坏的反对意见。Bendall解释说，很多人只是因为这一点便不予考虑该技术，但细胞被破坏“从来不是我们想做的任何事情的路障”。如果利用质谱流式细胞技术开展的试验辨别出一种令人关注的细胞类型，那么研究人员就能永远利用这一信息在传统流式细胞术的帮助下分离活细胞。

勾勒完美画面

Nolan、Bendall和Roederer都同意一件事情：金属标记物最有前途的应用是其有望改进未受损伤的组织切片的图像。而这均无法利用荧光流式细胞术和质谱流式细胞技术完成，因为两种技术要求细胞被分散到液流中。

一种被称为复合离子束成像的类似应用，将金属标记物应用到组织切片中，然后往里通入大量氧离子。氧离子同金属标志物发生反应，并将其从随行的抗体中去除。随后，当金属原子从组织中弹跳出来时，质谱仪便会测量金属原子。

斯坦福大学病理学家Michael Angelo表示，他利用该技术测量出每个细胞的45种参数。同时，该方法还记录细胞在诸如肿瘤中的位置。“这些是传统成像或基于流式细胞术的技术永远无法做到的。”Roederer表示。

去年，Nolan小组将该技术用于来自乳腺癌患者的组织样本，并采用10种被贴上金属标记物的抗体。该技术产生了随后以不同颜色呈现的组织样本的高清晰画面，以显示单个蛋白的位置。

在一项相关研究中，瑞士苏黎世大学免疫学家Bernd Bodenmiller和瑞士联邦理工学院化学家Detlef Günther及其同事开发出一种配套仪器。它能记录细胞位置，并指挥组织中的紫外线激光有条不紊地去除被标记的细胞，然后将它们送入大规模血细胞计数器中进行分析。Bodenmiller表示，该仪器能分析多达40种标记物。不过，Fluidigm公司首席技术官Scott Tanner介绍说，目前已有了更多可用的金属标记物，因此研究人员或许很快便能开展可得到更多参数的试验。

该技术产生的图像能阐明细胞如何对肿瘤中诸如低氧环境等局部条件作出反应。“它会为你提供更多关于样品本质的信息。”Tanner说。

他同时表示，对质谱流式细胞技术进行成像的应用不只限于癌症。神经生物学家告诉他，他们希望用其研究神经元是如何在大脑或脊髓中分布的。分析多种蛋白的能力则有助于研究人员破译神经细胞的功能及其如何同细胞在由关联神经元构成的网络中的位置关联起来。

Roederer和Nolan在不断地突破界限，但Roederer表示，他经常碰到关于这些改善有何用处的怀疑。当他获得8个参数时，研究人员会质疑这么多参数是否真的有必要。“当我获得12个时，人们又说‘这足够了吗？’‘你已经做完了吗？’”Roederer回忆说。

他并未停下脚步。Roederer希望明年能达到40个参数，并在此后获得更多。“每次我们达到一个新的‘天花板’，便会在几年内打破它。”（来源：科学网）